Dados do Trabalho

Título

APLICAÇAO DA ENGENHARIA GENETICA CRISPR/CAS9 EM MMP9 EM LINHAGEM DE CARCINOMA RENAL DE CELULAS CLARAS METASTATICA.

Introdução e Objetivo

A metaloproteínase de matriz MMP9 está diretamente associada à tumorigênese devido a sua função proteolítica e exerce funções fundamentais na invasão celular, remodelamento de matriz e a formação de um microambiente tumoral. Esse processo patológico é essencial na progressão do Carcinoma Renal de Células Claras e a MMP9 se apresenta como um importante fator prognóstico desse câncer. Na tentativa de minimizar esses efeitos tumorigênicos, visamos realizar a edição gênica da MMP9 através do sistema CRISPR/Cas9 em linhagem celular de carcinoma renal de células claras metastáticas (Caki-1). 

Método

Para os experimentos da ferramenta CRISPR/Cas9 foi utilizado o plasmídeo PX330. A seleção da sequência de sgRNA para a MMP9 foi feita pela plataforma MIT. Foram feitas as transfecções dos plasmídeos PX330 com o reagente Xfect™ Transfection Reagent. Para a síntese do cDNA do RNA utilizou-se o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription® (AppliedBiosystems), no equipamento PCR Veriti® (Applied Biosystem, Foster City, CA). A amplificação do material obtido foi realizada pela ABI 7500 Fast RT-PCR no modo standard utilizando-se Master Mix PCR TaqMan Universal (Applied Biosystems, Foster City, CA). As expressões gênicas foram estudadas a partir de análise estatística.

Resultados

A partir das transfecções realizadas obteve-se uma diminuição estatisticamente significante da expressão dos tratados guide 1 (p=0.0085) e guide 2 (p=0.0280) em relação ao controle, atingindo um resultado esperado.

Conclusão

Observamos que que após a edição da MMP9 através da técnica CRISPR/Cas9 obtivemos uma redução significativa da MMP9.Este resultado abre perspectivas para avaliar o efeito na linhagem celular causado pela perda da expressão de MMP9.